番茄高色素hp2基因的克隆、遗传转化及功能验证

【摘要】番茄(Lycopersiconesculentem.Mill)营养丰富,风味香郁,适应性广,产量高,在世界各地被广泛种植,并成为人们日常的主要蔬菜作物之一。在番茄突变体的果实中含有丰富的番茄红素,而番茄红素具有抗氧化、延缓衰老、提高免疫力和抗癌等功能,因而其食用价值和经济价值倍受关注,已成为国际功能性食物营养指标研究的热点之一,但我国在该方向的研究还处初级阶段。为了增加番茄采收时间、在市场上的上架时间,减少运输过程中的损伤率,近年耐贮型番茄已成为育种的主要目标,但耐贮型番茄普遍存在果实番茄红素含量较低的品质缺陷、并难以有效对其进行选择。随着分子生物学及基因组学的迅猛发展,运用重组DNA技术即基因工程改良作物品质已成为作物分子育种的主要高效途径。近年来,研究者发现了许多影响植物光代谢的单基因突变体,其中番茄高色素hp基因突变体能够提高类胡萝卜素含量,尤其对番茄红素含量的提高最为显著,为此,引起了众多育种者和研究者的高度重视。目前,已发现的hp类突变体中hp1,hp2和hp3对番茄红素含量的影响作用显著。而对于耐贮型番茄果实的番茄红素含量均普遍偏低的问题,已成为现今和未来商业及市场品质需求的一重大缺陷,快速、高效选育高番茄红素的耐贮型番茄品种已成为目前番茄品质育种中急于解决的主要问题之一,而关于耐贮型番茄相关的遗传转化报道也甚少,所以给耐贮型番茄的高效分子品质育种带来了诸多不便。为此,本研究以从美国番茄遗传研究所引进含有3种不同hp基因(hp1,hp2和hp3)类型的7个突变体和加工番茄为对照,通过番茄红素和品质的差异分析及相关分析,筛选其中1个对番茄红素起主导作用同时兼顾其他主要优良品质的hp基因类型为耐贮型番茄转hp基因的研究供体；建立和优化耐贮型番茄的再生体系和遗传转化体系；克隆该hp2基因全长并构建带有attR重组位点的pCAMBIA-1301入门载体；通过农杆菌介导方法将hp2基因导入耐贮型番茄中,获得转基因植株,并对其进行分子和生理指标检测分析,为hp基因在耐贮型番茄中的应用研究提供理论依据,为含高番茄红素的番茄创造新的种质资源。具体研究结果如下：(1)以含3种不同hp基因突变类型和不含hp基因类型番茄为材料,经其果实番茄红素含量的差异分析表明,含不同的hp基因类型番茄果实中番茄红素含量存在显著和极显著差异,含量趋势表现为hp2>hp1>hp3>无hp类型,其中hp2基因对番茄中番茄红素含量具有重要的主导作用,并且果实其他主要综合品质优良。(2)以含3种不同hp基因突变类型和不含hp基因类型番茄为材料,经其果实番茄红素与主要品质含量的相关分析表明,含不同hp基因番茄果实中番茄红素含量与其它5个主要果实品质指标相关性不显著,但均具有正向相关趋势,其相关大小分别为糖酸比>维生素C含量>可溶性蛋白含量>可溶性总糖含量>酸度含量。(3)以含hp2基因突变类型的LA3006和LA4013番茄为材料,通过RT-PCR方法对其进行基因克隆及载体构建分析表明,在番茄LA3006和LA4013中均可以成功获得含有attB序列的hp2全长基因,并构造了带有ccdB基因的重组位点的入门载体,命名为pCAMBIA一1301-ccdB和含hp2基因的植物双元表达载体,命名为pCAMBIA一1301-hp2。(4)以耐贮型番茄品种08076和09836为材料,通过子叶高频再生的方法,对其再生体系中的主要影响因子进行差异分析表明,在耐贮型番茄子叶高频再生体系中,不同番茄品种间仅在出芽数存在极显著差异,其他诱导和再分化影响因子指标差异不显著；其中耐贮型番茄子叶最优高频再生体系为：无菌苗的培养采用,种子用10%NaClO浸种15mmin消毒,MS培养基(进口,2.215g/L)+0.70%琼脂+2%蔗糖；无菌苗培养基采用1/2MS+0.7%琼脂+1%蔗糖；诱导愈伤养培养基为MS+6-BAlmg/L+IAA0.2mg/L；不定芽分化养培养基为MS+6-BA1.5mg/L+IAA0.75mg/L；生根培养基为MS+IAA2.0mg/L,其获得的耐贮型番茄再生频率表现为09836和08076的子叶分化率分别为100%、98.25%。(5)以耐贮型番茄品种09836为材料,利用农杆菌介导方法,对其进行遗传转化分析表明,hp2基因可以较好导入耐贮型番茄09836,其中在共培养时期,成活169份,成活率为42%；在不定芽分化时期,成活65个不定芽,成活率为38%；在生根苗时期,成活38份,成活率为58%；在抗性植株培养时期,最终获得到抗性植株14株,成活率为36%。(6)以遗传转化获得抗性植株为材料,经“目的PCR”.”NPTII基因”和“半定量RT-PCR”检测验证分析表明,确定8株表现阳性,分别为T0-01、T0-02、T0-05、T0-06、T0-08、T0-10、T0-12、T0-14,转化株的阳性率为57.14%。(7)以获得的阳性植株为材料,经方差和多重比较分析表明,果实中番茄红素含量、叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量均极显著获得提高,其中果实中番茄红素含量分别提高了309.64%-1571.08%；阳性番茄植株叶片中叶绿素a提高了139.45%-295.11%,叶片中叶绿素b提高了152.58%-376.29%,叶片中类胡萝卜素含量提高了20.32%-95.72%。(8)以获得的阳性植株为材料,阳性植株的果实番茄红素含量与叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量进行相关分析表明,T。代阳性株果实中番茄红素含量与其叶片中叶绿素a含量和类胡萝卜素含量呈正向显著相关,而与其叶片中叶绿素b含量呈正向极显著相关(r=0.79)；阳性株叶片叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量间存在极显著正相关。(9)通过转基因技术获得了3个转hp2基因的T2代耐贮型番茄09836株,其中T2-1、T2-5和T2-10的果实番茄红素含量分别为33.9.83.7.94.6mg/kg,较非转基因番茄对照提高了3.8-10.6倍；其果实的AS1分别为2.1、1.9和2.3,较对照下降了45.24%-54.76%；其果实货架期分别为48、42和53天,相比对照下降了27.4%-42.47%；其果实硬度分别为3.35kg/cm-2、3.02kg/cm-2和4.05kg/cm-2,相比对照下降了27.68%-46.07%。
【作者】李文枫；
【导师】李景富；
【作者基本信息】东北农业大学，蔬菜学，2014，博士
【关键词】番茄；hp2基因；遗传转化；基因克隆；番茄红素；

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